1. 取乙醚麻醉大鼠，迅速剪取其胸主动脉；取出后置于1-4 °C的容器中。

2. 用2ml的注射器取PBS或者高压灭菌的生理盐水。反复冲洗胸主动脉，去掉其表面粘附的凝血等组织块并剔净血管的周围组织。

3. 然后放入酶消化液中、在37°C的气浴恒温振荡器里消化45分钟，随胸主动脉的大小和酶液活性变化略加变动。当消化过程中观察到血管变透明、周围组织成絮状可终止消化随后剥离血管外膜层、刮除内膜层和剥离中膜层；

4. 含Ca²⁺、Mg²⁺的HBSS漂洗分离的中膜层，置于干净的培养皿进行快速剪碎(1-2mm³)，然后转入放有复合酶液的6孔板内进行二次消化，消化在细胞培养箱中进行，时间为I小时左右，每20分钟取出轻微晃动。消化50分钟后一般可观察到有大量细胞在组织块表面呈葡萄状暴露并开始游离出来这时候加平滑肌细胞培养基终止消化，备注：终止消化的培养基需提高血清含量到10%。

5. 用1ml的注射器抽打组织消化液直至细胞基本从组织残片中脱离，再用细胞筛过滤（细胞筛孔径为40um）获得悬液；取滤网上的组织，重复抽打和过滤，将多次过滤后的细胞悬液一起转移到15ml的离心管里，1000转/分、离心5分钟收集细胞。

6. 取含10%FBS的平滑肌细胞培养基悬浮细胞，种入6孔板进行培养。

7. 新鲜分离的P0代VSMC悬浮于平滑肌细胞培养液中，于孵箱里静止培养2天，37 °C，5 %CO2。

8. 48小时后观察，发现细胞已贴壁并开始铺展更换新的平滑肌细胞培养基，培养7天左右可传代，传代后血清降至2%的正常血清。